单核细胞增多综合症
Huntingtin聚合与Huntington舞蹈病By: user18789, 2007/04/05 17:50 许多神经退行性疾病是由于蛋白质构型改变,在中枢神经细胞内蓄积和聚合引起的。Huntington舞蹈病(Huntington's Disease, HD)是一种神经退行性疾病。它是由蛋白质多聚谷氨酰胺延长引起的9种疾病之一,其特征是中枢神经系统的神经元中出现包涵体(inclusions)和聚集体(aggregates), 包涵体和聚集体的主要成分是由含延长多聚谷氨酰胺序列的Huntingtin多片段聚集形成的纤维状蛋白质,是无膜包绕的结构,大小为5~7Lm。
HD的病程及诊断
HD的主要症状是舞蹈伴有认知障碍和精神异常,有家族史。通常在35~50岁出现,在症状首次出现15~20年后死亡。HD大致可分成3个阶段,疾病早期表现为协调能力的改变及轻微的非自主运动、思考能力下降、情绪抑郁或易怒。疾病中期以舞蹈症状为主,伴有自主运动障碍、吞咽困难及发音困难。疾病晚期有严重的舞蹈病症状、行动缓慢或丧失躯体运动功能。患者多伴有痴呆,卧床,但仍保留一定的理解能力。一般通过是否有家族史以及典型的舞蹈病症状和认知障碍来进行HD的诊断。但也存在病例无家族史,症状不典型,给诊断带来一定困难。基因检查可以准确诊断HD。
Huntingtin基因
Huntingtin基因(IT15,Huntingtin)发现于1993年,导致该疾病的突变基因IT15由67个外显子组成,位于人第4号染色体上,在染色体4p1613的D4S127和D4S180之间。HD基因编码一个相对分子质量为3.5×10*5Da的蛋白质,该蛋白由3144个氨基酸组成, 被命名为亨廷顿蛋白(Huntingtin,Htt)。从Htt氨基末端第17位氨基酸残基开始有一段重复的谷氨酰胺(CAG)序列。HD的发生是由Htt的N2末端的多聚谷氨酰胺序列的过度延长引起的。它的长度在正常人群中短于35个,而在HD患者中突变Htt的谷氨酰胺长度超过36个。多聚谷氨酰胺序列的长度与发病年龄具有相关性,延长的长度越长发病越早。大部分成年后发病的患者其多聚谷氨酰胺序列在36~50个之间,而青少年发病患者的多聚谷氨酰胺序列则大多超过了60个。50%~60%的发病年龄与CAG重复序列的长度有关,但对于患者个体来说,通过CAG重复序列的长度来预测发病年龄并不是非常有效。
正常人群Htt蛋白广泛存在于大脑、睾丸、心脏、肝脏和肺中。胚胎发育、造血以及神经形成过程中,Htt蛋白是必需的。Htt可促进脑源性神经营养因子的转录从而发挥其抗凋亡作用。另外,它可与促凋亡蛋白Huntingtin结合蛋白1(HIP1)结合调控caspase28依赖的凋亡途径。Htt一般存在于细胞质中,与一些细胞内物质转运及细胞内外分泌调控有关的蛋白质相结合,提示其与细胞器的微管转运及细胞内吞作用有关。在细胞核中也发现存在Htt,具有调控转录因子作用。
Huntingtin包涵体及聚集体
获得Huntingtin基因克隆和特异性的抗Huntingtin抗体后,DiFiglia等人首先在HD患者大脑病变区域的神经细胞核内发现了Huntingtin包涵体(neuronal intranuclearinclusions)。Davies等人随后在HD转基因动物脑神经细胞胞质内发现了Huntingtin免疫活性阳性的聚集体(aggregates)和核内包涵体(Intranuclear inclusions)。Huntingtin聚集体和核内包涵体已成为HD中一种标志性的神经组织学特征。聚集体和包涵体两者的形态和组织化学特性相同,只是发生部位不同而已。
Huntingtin包涵体及聚集体的形成机制
在舞蹈病和其他由谷氨酰胺(glutamine)重复序列延长引起的神经退行性病变中,蛋白聚合体形成与谷氨酰胺重复序列长度有关。Green提出假说:随着多聚谷氨酰胺的过度延长,Htt蛋白在转谷氨酰胺酶的作用下发生交联而形成聚集体。相邻蛋白质的谷氨酸和赖氨酸残基的侧链在转谷氨酰胺酶催化下可形成异构肽交联。大脑中广泛分布着转谷氨酰胺酶,在神经细胞中发现3种不同的转谷氨酰胺酶。在HD患者大脑中可见转谷氨酰胺酶的增加,其底物是多聚谷氨酰胺。转谷氨酰胺酶催化的交联反应使Htt蛋白聚合成高分子量多聚体。HD中转谷氨酰胺酶的作用正日益受到关注。
谷氨酰胺有一极性铵基侧链可与水形成氢键。Perutz提出,在主链和侧链酰胺基之间氢键连接(polarzippers)的作用下,多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物。聚合体是由反向排列的B2折叠不断增加形成的,B2折叠之间由侧链和主链中氢键将其连结在一起。当谷氨酰胺重复序列增长时,可促使蛋白质构型从随机缠绕(randomcoil)向B2sheet转化,当Huntingtin中谷氨酰胺重复序列长度超过37个谷氨酰胺时,形成的B2sheet构型就比较稳定。Hazeki等将带有Q77Huntingtin的N2端片段转染至细胞中,观察到了包涵体的形成。将细胞提取物于100%甲酸中孵育,大部分聚合体都降解成了单体(65000),但在130000处依旧可见条带。130000处的条带可能是含多聚谷氨酰胺多肽之间的交联。由此得出结论,大部分聚合体是通过氢键来稳定的,其间也有转谷氨酰胺酶催化的交联反应参与。
Huntingtin包涵体及聚集体的组成
HD的发病机制主要与多聚谷氨酰胺的延长引起的毒性有关。有实验证实重复谷氨酰胺序列过度延长后,Huntingtin淀粉样纤维生成率明显增加,因此认为HD的发病机制与聚集过程密切相关。Hazeki等报道Huntingtin聚集体的主要成分是Huntingtin的N2端片段,其间结合hnRNPF/H、组蛋白H3/H4、核转运蛋白RanBP32a、Dbp25及泛素。hnRNPs的损耗抑制了神经元细胞mRNA的剪接,进而导致神经元失能。秦正红等报道聚集体的纤维内部包含cathepsinD、ubiquitin、热休克蛋白(HSP40),不易被蛋白酶降解。聚集体外部为直径14~34nm的球状物,对蛋白酶敏感。HSP70、dynamin、HIP1、SH3GL3等在细胞内正常位置均有所减少,并在聚集体的外部重新分布。细胞质中突变Htt(mHtt)与囊泡转运有关的蛋白质结合从而导致神经元失能。另据报道,在HD动物模型和细胞模型的mHtt聚集体中发现有ubiquilin1、ubiquilin2和Tollip,这些蛋白质均含有与泛素结合的模序,当其与mHtt形成聚集体后,可影响蛋白质降解的泛素/蛋白酶体通路,破坏神经元的正常功能。
在疾病早期mHtt可导致线粒体功能失衡,自由基损伤,钙转运失调,继而活化calpain等蛋白酶。线粒体失能也可诱导细胞色素C、HTRA2、Smac/DIABLO等促凋亡因子的释放及caspase的活化,从而引起氧化应激和兴奋性毒性,能量代谢障碍。这些促凋亡因子可促进细胞质中IAPs(inhibitorofapoptosisproteins)降解, 继而导致细胞死亡。另外,野生型的htt可与HIP21结合,突变的htt释放HIP21,HIP21与hippi结合活化caspase28诱导凋亡。单体、聚集中间体以及一些成熟的聚集体之间是哪种形式具有细胞毒性目前很难得出结论。很可能错误折叠的单体,原纤维(protofibril)的毒性比成熟的聚集体要大,原纤维(protofibril)的非天然的疏水基团的暴露有可能增强细胞膜和一些细胞内成分的异常的相互作用。
Huntingtin包涵体及聚集体的降解
一系列的证据表明蛋白酶体的功能与HD的病因之间存在着一定联系。在Htt包涵体通常连接有泛素。在阻断了突变htt的表达后,加入蛋白酶体抑制剂lactacystin或epoxomycin,huntingtin的清除相应减少。蛋白酶体并非直接降解聚集的mHtt,因为聚集形式的蛋白并不能通过蛋白酶体通道。Verhoef等证实,可溶性的mHtt可由蛋白酶体降解,一旦聚集则可抵抗蛋白酶体的降解。聚集的形成会引起蛋白酶体的损伤,既而引起很多短半衰期的调节蛋白如转录因子也受到损伤,从而导致细胞死亡。Jana报道蛋白酶体活性的降低伴随细胞死亡、caspase23、9的活化以及线粒体的破裂。用蛋白酶体抑制剂lactacystin处理细胞,可发生caspase的活化和线粒体失能,提示在HD模型中这些改变是由蛋白酶体的损伤引起的。蛋白酶体不能有效降解突变的Htt,可能是Huntingtin错误折叠和聚集的原因之一。
在mHtt的降解中,还存在着非蛋白酶体途径。当加入自噬体形成抑制剂32MA(32甲基腺嘌呤)或二甲基腺苷或自噬体2溶酶体的融合抑制剂bafilamycinA1时,可溶性Htt蛋白水平则上升,聚集体的形成也相应增加。自噬激活剂rapamycin可使聚集体清除增加,可溶形式的突变蛋白减少。由于自噬发生在细胞质,故其对核内聚集体降解作用不大,因而核内聚集体相对于胞质聚集体而言其毒性更大。另外,HD小鼠模型亦可见自噬体的增加。自噬体可能是逃离了蛋白酶体降解途径的突变Htt聚集体蛋白清除的途径。
Huntingtin蛋白的剪切
Htt是许多蛋白酶的底物,在Htt上有caspases、calpains、asparty1蛋白酶的剪切位点。caspases可以自身激活,突变mHtt也可使其激活,一旦激活可与Htt结合并使其部分降解。含正常长度谷胺酰胺残基的Htt碎片在细胞内并不蓄积,它们可被泛素2蛋白酶体系统有效清除,含延长的谷胺酰胺残基的Htt碎片发生聚合从而不能进入蛋白酶体的核心,使清除延迟并在细胞质或细胞核内积聚。
未被剪切的Htt通常在细胞质和细胞核之间穿梭,由于Htt缺乏传统的核定位序列(NLS),很可能Htt与含有NLS的其他蛋白结合共同转运至核内。但是,Htt具有出核信号(NES),可以独自转运出核。由于大部分与Htt结合的含有NLS的蛋白结合在Htt的N2端,而Htt的NES在C2端的剪切位点附近。Htt蛋白水解后,将使其调控出核和进核的片段分离,从而使N2端的碎片滞留细胞核内。核内聚集体一般仅由突变Htt(mHtt)的N2端片段组成,细胞外的神经元包涵体由全长的mHtt和剪切后的Htt片段共同组成。因此,mHtt的剪切对于核内聚集体的形成非常重要。
被剪切的氨基端Htt片段含有延长谷胺酰胺残基,在细胞内蓄积后易形成Htt聚合体。延长谷胺酰胺残基的Htt碎片对细胞具有毒性。mHtt的剪切片段越短,其细胞毒性越大,对转录的影响也越大。mHtt的剪切片段可与P53、CBP、CREB、GAPAH、SP1结合从而影响转录,引起细胞死亡。有报道认为,细胞企图隔离这些有毒性的片段,故而形成了包涵体。另外,有研究发现mHtt可抑制乙酰基转移酶的活性,乙酰基转移酶可修饰蛋白,激活所需基因,而去乙酰基转移酶逆转该过程,关闭所需基因。mHtt破坏了乙酰基转移酶的平衡,从而干扰基因的转录。
针对蛋白质错误折叠可能采取的治疗途径
目前采取的治疗途径主要从Htt聚集体和核内包涵体的形成和清除以及抑制Htt的剪切活性方面寻找药物作用靶点。已报道的相关药物有:
转谷氨酰胺酶抑制剂 Htt聚集体和核内包涵体的形成与转谷氨酰胺酶有关,mHtt可激活转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶催化Htt中谷氨酰胺之间的交联,促进形成稳定的Htt聚集体。转谷氨酰胺酶抑制剂能抑制Htt聚集体的形成、减低mHtt的毒性,转谷氨酰胺酶抑制剂用于mHtt转基因小鼠可延长其生存期,减轻运动失调的症状。
对分子内B2折叠有亲和力的化合物 Sanchez等在HD细胞模型中用刚果红证实了这一设想。刚果红是一种偶氮染料,它可抑制Huntingtin淀粉样纤维的生成,促进R1/2小鼠模型Htt聚集体的清除并改善其运动功能。Heiser等用AFRA法(automatedfilter retardationassay)高通量筛选可预防聚集体形成的化合物,实验证明苯并噻唑类衍生物(Benzothiazole derivatives)也可结合在B2折叠结构上,影响Huntingtin淀粉样纤维的生成。Heiser等也证明用多聚谷氨酰胺的特异单克隆抗体可预防mHtt聚集体的形成。
分子伴侣 Hsp70和Hsp40等与泛素/蛋白酶体途径清除错误折叠蛋白质的过程有关,mHtt引起的损伤可诱导分子伴侣表达增加,促进清除聚集体。HD细胞模型加入上调热休克蛋白的化合物,高水平的分子伴侣可增加可溶形式的蛋白,促进清除。
蛋白酶抑制剂 Htt的剪切是HD病因中很关键的步骤,抑制Htt的剪切活性可减少mHtt蛋白的毒性。一些可抑制蛋白酶活性的药物或许可用于HD的治疗。caspase抑制剂Z2VAD2fmk和cystamine治疗HD小鼠模型,可推迟其运动失能,并延长其生存期。抗caspase活性药物minocycline也可延长R1/2小鼠的生存期。此外,转谷氨酰胺酶抑制剂cystamine也具有潜在的抑制caspase23的活性。
自噬激活剂 促进自噬的药物rapamycin可减少HD细胞模型中的聚集体并降低细胞死亡,有研究表明,当对HD模型小鼠采取持续的饮食控制时,Htt聚合体形成及凋亡蛋白酶活化减少、运动异常减少。可能的解释是饮食控制,限制高糖高蛋白食物的摄入可提高机体细胞自噬水平,从而提高自噬对mHtt蛋白的清除。自噬很有可能成为治疗舞蹈病的新靶点。
由于不确定在蛋白质聚集过程中哪个环节产生的毒性物质毒性最强,一些抑制剂有可能引起某些中间体的蓄积而加重疾病。也有实验表明包涵体的形成与mHtt引起的细胞死亡无关,甚至有利于降低游离的N片段的浓度,短期内对细胞可能有益。Htt聚合体形成抑制剂能否可以成为治疗HD的一个靶点仍需深入研究。目前关于HD的发病机制尚不完全明了,也缺乏有效的治疗方法,认识导致HD的原因和途径,是治疗HD的关键。HD研究的进展势必对与蛋白质错误折叠有关的神经退行性病变的治疗产生积极的影响。
~ 中国医院数字图书馆
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